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生物样品处理与芯片杂交(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-02

生物样品的制备和处理是生物芯片技术的第二个重要环节。生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片进行反应。要将样品进行特定的生物处理,获取其中的蛋白质或DNA、RNA等信息分子并加以标记,以提高检测的灵敏度,第三步是生物分子与芯片进行反应。芯片上生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件,使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配比率,从而获取最能反映生物本质的信号。生物芯片技术的最后一步就是芯片信号检测和2018白菜网址大全。目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置,经相关软件2018白菜网址大全图像,即可以获得有关生物信息,其流程如图13—7所示。

生物芯片技术之所以成为新技术,就是能够用相对简单快捷的方法完成以往极为复杂、耗时甚至不可能完成的工作。尽管生物芯片技术能够提供极为丰富的信息,而使用芯片的流程却并不复杂。

一、样品的制备和处理

目前,由于灵敏度所限,多数方法需要在标记和2018白菜网址大全前对样品进行适当程序的扩增,不过也有不少人试图绕过这一问题,如Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法,引物特异性强,无交叉污染并且省去了液相处理的繁琐;LynxTherapeutics公司引入的大规模并行固相克隆法(Massively parallel solid-phase cloning),可在一个样品中同时对数以万计的DNA片段进行克隆,且无需单独处理和分离每个克隆。高度集成的微型样品处理系统,如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记,目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法,如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异,只是采用的荧光素种类2018老虎机白菜大全,这可以满足不同来源样品的平行2018白菜网址大全。

生物样品往往是十分复杂的生物分子混合体,而我们所需的往往是其中极微量的一部分,如前所述,根据样品来源、基因含量、检测方法和2018白菜网址大全目的的不同,采用的核酸分离、扩增和标记方法各异。用于基因芯片2018白菜网址大全的核酸样品主要有cDNA、DNA、aDNA(Anti-sense RNA)。cDNA主要是用于检测基因的表达情况。以DNA和aDNA为杂交靶样品主要用于基因分型(Gene typing),单核苷酸多态性(SNP)2018白菜网址大全和基因测序(Microsequencing)等。

(一)单链化处理

杂交DNA经PCR扩增得到的是双链DNA产物,杂交前双链结构需经变性处理。一般是较高温度下(980C或1000C)保温数分钟使双链解离。也可室温下加入适量强碱0.05mol/I。NaOH:或酸性溶液反应数分钟使双链退火,但后续的中和、洗脱过程繁琐,并给杂交体系带入了新的干扰因素。更为重要的是,在杂交过程中互补链仍会与探针竞争与靶链:DNA的杂交,使反应体系中实际用于杂交的靶序列浓度降低,从而影响杂交效率。所以较理想的是只得到大量的单链产物。将PCR扩增产物由TTRNA聚合酶体外转录成aRNA可以为杂交提供足量的单链核酸,比单纯PCR产物用于杂交更具有优势。并且转录过程中,实现的是单链的重复性线性扩增,易于量化控制。1个DNA分子在转录体系中可得到100个有效的aRNA分子,完全可以满足用于杂交的核酸靶序列量的要求。

(二)Genomic DNA的分离纯化

对于Genotyping、SNP2018白菜网址大全和Genomic Chip来说,要检测基因组或者染色体上的突变,就需要制备样品的基因组DNA而非RNA以进行检测。

现在可以根据不同的样品来源,可以选择特定的试剂盒。QIAGEN公司专利的样品纯化技术,可方便快速地从多种样品中纯化高质量的GenomicDNA,无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。(试剂盒的使用简介见图13—8)。

(三)靶序列长度的处理

cDNA芯片常用于表达谱2018白菜网址大全。由于其上固定的是较长的核酸序列,所以对靶序列长度没有太高的要求。而寡核苷酸芯片探针序列较短,一般2030bp(有的公司如oper-on公司开发出了探针为70me的寡核苷酸芯片)。在一些检测特异性较高的实验中,如杂交测序(SBE)、单核苷酸多态性(SNP)和点突变检测方面具有无比的优越性。由于存在空间位阻对靶核酸的长度也有要求,较长的DNA容易形成发卡状二级结构,杂交时形成空间位阻将降低探针与靶样品的杂交效率。较长的aRNA同寡核苷酸芯片的杂交效果也不甚理想,也会由于内部的碱基配对,阻碍杂交时异源双链体的形成。

采取适当的方法获取合适长度的寡核苷酸片段(20200bp),可以避免长链二级结构产生的负面影响,提高杂交效率,增加特异性。

参考资料:现代食品检测技术

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生物样品处理与芯片杂交(一)


【关键词】生物,样品处理,芯片杂交,食品检测国家标准物质网 

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