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探针标记物与标记方法(三)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-02

(1)T4多核苷酸激酶标记法:T4多核苷酸激酶的作用是催化ATP分子上的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’-OH基团上。因此,采用γ一32p—ATP为底物,即可将寡核苷酸5’末端标记。该法的缺点是在每个探针的5’末端多加了一个磷酸,理论上,这会影响其与DNA的杂交,因此,有人建议使用Klenow DNA聚合酶的链延伸法获得高放射活性的寡核苷酸探针。

(2)Klenow DNA聚合酶标记法对于带黏性末端的双链寡核苷酸,可利用Kle-now DNA聚合酶的填充反应进行末端标记;而对于单链寡核苷酸,则可预先合成一小段(如8-mer)与此探针互补的寡核苷酸作为引物,然后利用Klenow DNA聚合酶的链延伸反应获得标记的寡核苷酸探针。此法的特点是模板DNA与标记的DNA探针的长度不相同,因此可采用电泳方法将它们分离开来。

(3)末端脱氧核苷酰转移酶标记法末端脱氧核苷酰转移酶能催化dNTP在单链DNA3’末端的多聚化。在Co2+替代正常辅助因子Mg2+的情况下,也可利用双链DNA作为底物。

(二)探针的非放射性标记法

非放射性标记物主要有两种类型:一类是预先已连接在NTP或dNTP上,因此可像放射性核素标记的核苷酸一样,用酶促聚合方法掺入到核酸探针上,如生物素、地高辛(DIG)等;另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上。这里重点介绍非放射性DIG(地高辛)标记方法。

1、PCR标记法

在PCR反应中,热稳定聚合酶(如Taq聚合酶)能数以百万倍地快速扩增靶DNA,聚合酶以DNA为模板催化dNTP的聚合反应,其中掺入适宜比例的DIG—dUTP,扩增的DNA片段即被DIG标记,敏感性和特异性都很高,PCR标记反应的特异性使得这种技术特别适合于合成短序列的探针(图12—2)。PCR标记的探针特别适合于在基因组Southem印迹中检测单拷贝基因序列和Northern印迹中稀有mRNA的检测。当然,也适合于文库筛选、斑点/狭缝印迹和原位杂交。

PCR标记法(PCR Labeling)可以从非常少量的模板产生大量的标记探针,模板的量从10—100pg,质粒或l~50ng基因组DNA均可。然而,就经验而言,10pg质粒或10ng基因组DNA产生的结果最佳,克隆质粒的插入序列比基因组DNA会产生更好的结果。PCR引物序列的特异性决定了哪一区域被扩增和标记。模板的质量一般不影响PCR标记反应,甚至煮沸法获得的质粒也可用作模板,也意味着比其他标记方法,反应条件更需要优化。当模板数量非常有限,或模板不是很纯,或模板很短时,首选PCR法制备DIG标记探针。

2、体外转录标记RNA探针

体外转录标记。RNA探针(RNA labeling)是在体外由DNA模板转录产生。DNA片段被插入到载体的多克隆位点中,在其两边有不同的:RNA聚合酶启动子(例如,17,SP6、13RNA聚合酶),反应前模板需要线性化 (在插入序列附近),在RNA聚合酶作用下则插入的DNA序列转录成互补RNA序列,反应中加入DIG—dUTP,模板DNA可被转录许多次(可达100倍之多),产生出大量的全长的DIG标记的RNA探针(在标准反应中,1μg DNA可产生10—20μg RNA),大约每25~30中核苷酸可掺入一个DIG标记的UTP(图12—3)。

特异性模板序列位于启动子(例如T7,SP6,或T3RNA聚合酶)的下游。模板可以是高度纯化的线性化质粒DNA或有启动子序列的PCR产物。标记的RNA探针非常敏感,事实上,对于检测RNA标本而言,DIG标记的RNA探针比DIG标记的DNA探针更敏感。所以,RNA探针特别适合于Northern印迹中稀有mRNA的检测,也适用于Southern印迹、文库筛选、斑点/狭缝印迹和原位杂交。

比较而言,产生DIG标记DNA探针最灵活和强有力的方法是:PCR的方法,特别是得不到高纯度的模板时。如果能得到高纯度的模板,则随机引物标记法也能产生出同样敏感的探针。DIG标记的RNA探针在检测RNA靶基因时最敏感。

三、探针的纯化

DNA探针标记反应结束后,反应液中仍存在未掺入到DNA中去的dNTP等小分子,需纯化将之去除,否则会干扰下一步反应。探针纯化方法分述如下。

(一)凝胶过滤柱层析法

利用凝胶的分子筛作用,将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸(<80bp)等分离。大分子DNA流出,而小分子则滞留于凝胶层析柱中。常用的凝胶基质是Sephadex G-50和Bio-GelP-60。

(二)反相柱层析法

反相柱层析法是一种分离效果极好的层析方法。具体步骤是将注射器套在Nen-sorb柱上,吸取lmL甲醇洗柱,活化树脂;用2mL0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)平衡层析柱;DNA样品用0.1mol/L Tris C1(pH 8.0)稀释至1mL,推过层析柱。收集流出液重新过柱1次;用2mL0.1mol/L Tris·Cl(pH 8.O)洗柱;用2mL水洗柱;用0.5mL 50%乙醇洗脱层析柱,收集流出液;乙醇或异丙醇沉淀。70%乙醇洗涤。DNA沉淀重溶于TE中。

(三)乙醇沉淀法

DNA可被乙醇沉淀,而未掺入DNA的dNTP则保留于上清液中,因此,反复乙醇沉淀可将两者分离。用2mol/L乙酸铵和乙醇沉淀效果较好,连续沉淀两次,可去除99%的dNTP 。蛋白质在此条件下多不会被沉淀。如DNA浓度较稀(<10pg/mL),可加入10μg酵母tRNA共沉淀。

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

探针标记物与标记方法(一)

探针标记物与标记方法(二)


【关键词】探针,标记物,标记方法,食品检测国家标准物质网 

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