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生物样品处理与芯片杂交(三)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-02

(一)芯片的制作方法

1、原位合成法

原位合成有两种途径,一是原位光刻合成,二是压电打印法(Piezoelectric printing)。

(1)原位光刻合成:这是一项由美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术,是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸,通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如合成想要8核苷酸探针,通过32个化学步骤,8h可合成65 536个探针。而如果用传统方法合成然后点样,那么工作量的巨大将是不可思议的。同时,用该方法合成的探针阵列密度可高达106/cm2。采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基。首先使支持物羟基化,并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取适当的蔽光膜(mask),使需要聚合的部位透光,其他部位不透光。这样,光通过蔽光膜照射到支持物上,受光部位的羟基脱保护而活化。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化,另一端受光敏保护基的保护,所以发生偶联的部位在反应后仍旧带有光敏保护基团。因此,每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化,以及所用单体的种类和反应次序,就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。使用多种蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列,在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸,通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。基本原理如图13-lO所示。

(2)压电打印法(Piezoelectric printing):原理与普通的彩色喷墨打印机相似,所用技术也是常规的固相合成方法。不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是四种碱基合成试剂。喷印头可在整个芯片上移动。支持物经过包被后,根据芯片上不同位点探针的序列,需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相合成技术。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致,因此不需要特殊制备的化学试剂。每步产率可达到99%以上,可以合成出长度为40~50个碱基的探针。

尽管如此,原位合成方法仍然比较复杂,除了在基因芯片研究方面享有盛誉的Affymetrix等公司使用该技术合成探针外,其他中小型公司大多使用合成点样法。

2、点样法

点样法是将预先通过液相化学合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量2018白菜网址大全后,通过由阵列复制器(Arraying and Replicating Device ARD)或阵列点样机(Arrayer)及电脑控制的机器人,准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上(支持物应事先进行特定处理,例如包被以带正电荷的多聚赖氨酸或氨基硅烷),再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。点样的方式分两种,其一为接触式点样,即点样针直接与固相支持物表面接触,将DNA样品留在固相支持物上;其二为非接触式点样,即喷点,它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高,通常1cm2可打印2500个探针;缺点是定量准确性及重现性不好,打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确,重现性好,使用寿命长;缺点是喷印的斑点大,因此探针密度低,通常只有1 cm2400点。点样机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印头、一个减振底座,上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。检验点样仪是否优秀的指标包括:点样精度、点样速度、一次点样的芯片容量、样点的均一性、样品是否有交叉污染及设备操作的灵活性、简便性,等。

3、分子印章原位合成法

分子印章技术与上述两种方法在合成原理上相同,区别仅在于该技术利用预先制作的印章,将特定的合成试剂,以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。后续反应步骤类似于压电打印原位合成技术。分子印章类似于传统的印章,其表面依照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面,依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定位点,进而进行合成反应。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章,即可在支持物上原位合成出位置和序列预定的寡核苷酸或寡肽阵列。从这一点上讲,分子印章原位合成技术与压电打印原位合成技术更为相似。分子印章除了可用于原位合成外还可以点样方式制作微点阵芯片。例如已有人将分子印章技术用于蛋白微点阵芯片的制作。

以上三种原位合成技术所依据的固相合成原理相似,只是在合成前体试剂定位方面采取了不同的解决办法,并由此导致了许多细节上的差异。但三种方法合成时,都解决的问题是确保不同聚合反应之间的精确定位,这一点对合成高密度寡核苷酸或多肽阵列尤为重要。同时,由于原位合成每步合成产率的局限,较长(>50nt)的寡核苷酸或寡肽序列很难用这种方法合成。但是,由于原位合成的短核酸探针阵列具有密度高、杂交速度快、效率高等优点,而且杂交效率受错配碱基的影响很明显,所以原位合成的DNA微点阵适合于进行突变检测、多态性2018白菜网址大全、表达谱检测、杂交测序等需要大量探针和高杂交严谨性的实验。

(二)芯片片基的制作

用点样法制作芯片,除了专用的仪器外,还需要选择合适的固相支持物——芯片片基,也就是载体材料。一般来说,各种芯片片基都选择经过相应处理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等作为支持物。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定),并与保护基建立共价连接;作点样用的支持物,为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子,通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。我们在下面介绍一些常见的相关产品:

膜:与玻片相比,膜的优点是与核酸亲和力强,杂交技术成熟,通常无需另外包被。由于尼龙膜与核酸的结合能力、韧性、强度都比较理想,以膜为基质的芯片绝大多数采用尼龙膜。

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

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【关键词】生物,样品处理,芯片杂交,食品检测国家标准物质网 

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