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杂交信号检测和结果运算(一)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-03

一、杂交信号检测

当生物芯片和样品探针杂交完毕后,就需要对杂交结果进行图像采集和2018白菜网址大全。一般膜芯片的杂交都用同位素p32、p33作标记,其信号的检测需通过传统的磷光成像系统来完成,而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测,则需要用专门的荧光芯片扫描仪。

(一)磷屏成像系统

膜芯片的杂交DE信号检测需通过的磷光成像系统来完成。Cyclone磷屏成像系统(Cyclone StoragePhosphor System)为美国Packard公司生产的第一台集高分辨率、高灵敏度和5个数量级的线性范围于一身的计算机控制数字化自动放射成像2018白菜网址大全系统,由于其使用方便、快捷、自动化程度、分辨率、图像清晰度均很高,既可定位也可定量,目前已广泛应用于核医药学、细胞与分子生物学、生物化学、药理学、基因工程学、药物代谢动力学、放射免疫及受体免疫等多方面实验研究,成为十分方便的有力工具。其优异品质主要得益于Packard专利的激光技术和共聚焦成像系统。应用范围为DNAMaeroal7.av以及Northern、Southern、Western Blot手工测序,放射性原位杂交等的同位素结果检测。使用Cyclon磷屏可以大大缩短研究周期,获得清晰的分辨率。

1、工作原理

同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光,曝光过程p32等核素核衰变同时发射卢射线,首先激发磷屏上分子,使磷屏吸收能量,分子发生氧化反应,以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏,对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应,即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放,从而在PMT捕获进行光电转换,磷屏分子回到还原态。计算机接受电信号,经处理形成屏幕图像,并进一步2018白菜网址大全和定量。一般化学发光物质如荧光染料标记样品成像过程与放射性类似。

2、系统特点

(1)放射性自显影成像系统。储存式磷屏根据不同样品厚度、射线能量有多种型号磷屏可供选择,磷屏可以多次重复使用。

(2)灵敏度较X光片高数十倍,可以检测最弱的信号。曝光时间可以缩短20倍以上。

(3)快速成像,从对磷屏进行扫描到获得完整的数字化图像,总共需要不到10min的时间,实时图像显示,同时立即报告2018白菜网址大全结果。

(4)可对放射性位置和强度进行相关的定位、定量2018白菜网址大全,宽达105的线性范围,定量准确。

(5)不需胶片、暗室设备、冲洗底片,一步到位完成2018白菜网址大全过程。

(6)可选配Ouant ArrayTM软件,用于尼龙膜上同位素标记的Gene Array定量2018白菜网址大全。

(二)荧光检测的原理

荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列2018白菜网址大全中,多色荧光标记可以在一个2018白菜网址大全中同时对两个或多个生物样品进行多重2018白菜网址大全,多重2018白菜网址大全能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性,排除芯片与芯片间的人为因素。

对于以核酸杂交为原理的检测技术,主要过程为:首先用生物素标记经扩增(也可使用其他放大技术)的靶序列或样品,然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素(常用的荧光素还有lassamine和phycoerythrin)作为显色物质,图像的2018白菜网址大全则用落谢荧光显微镜(Epifluorescence microscope)、激光共聚焦显微镜或其他荧光显微装置对片基扫描,由计算机收集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行2018白菜网址大全。由于完全正常的Watson-Crick配对双链要比具有错配(Mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性,所以,前者的荧光强度要比后者强出5%~35%。从这一点来说,该检测方法是具有一定特异性的,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。

(三)荧光探针

目前用荧光探针作为检测信号的仪器,主要是考虑荧光标记所要检测的DNA的效率,以及荧光探针本身的发光效率和光谱特性。

1、PCR过程中的DNA标记

(1)末端标记:在引物上标记有荧光探针,在DNA扩增过程时,使新形成的DNA链末端带有荧光探针。

(2)随机插入:选择四种碱基,使其中一种或几种挂有荧光探针,在PCR过程中,带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基,同时参与DNA链的形成。由于带有荧光探针的碱基,可能影响PCR的产物,因此需要调整荧光标记的碱基与未标记的碱基比率,以使得PCR产量和带有荧光探针的碱基在DNA的插入率达到一个平衡的水平,使杂交信号最强。

2、RNA转录过程的荧光探针标记

某一种碱基标记有荧光,但要求该种碱基标记与非标记按一定比率混合,以达到最佳转录效果。

3、荧光探针的选择

主要考虑以下几个因素:①荧光探针的激发和发射频谱;②荧光探针的发光效率;③荧光探针对PCR或逆转录效率的影响;④不同荧光探针的发射光谱是否有重叠。

常用的荧光探针:FITC,CY-3,ALEAX488,CY-5,ALEAX564。

(四)聚焦扫描和CCD扫描仪

一旦荧光标记样品和微阵列反应后,未结合的成分就可洗去,结合到芯片的样品可通过荧光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描主要是利用玻璃基质小区域(约100μm2)的激光发晒透镜(或两者)使整个影像聚集,每个位点上带荧光的样品发射的光通过一系列的反光镜,光片和晶体后与不要的光分开,然后被光电倍增管(或一种类似的装置)转换成一种电信号。聚焦扫描聚焦数据的速度(1-5min)要比传统实验中的放射自显影快得多(1~10d),快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。CCD相机利用许多与聚焦扫描仪相同的原理聚焦荧光影像。

(五)激光共聚焦扫描技术

所有的微阵列上,荧光需经荧光扫描装置来2018白菜网址大全其上的荧光强度和分布,在这些装置中,激光共聚焦扫描仪具有优越的性能,能获取高质量的图像和数据。

微阵列是由分子整齐排列于固相表面,这些分子与荧光分子结合,测定荧光分子的强度后可推知结合分子的浓度。固相部分主要有经过表面化学处理的玻璃片,如22mm×75mm的载玻片。在微阵列上包被的分子常常能与多种荧光探针通过化学键相互作用而联结,通常情况下能联结两种荧光分子,例如在检测不同样品的基因表达的区别时,可将其中一样品(如正常组织)标记上发绿光的荧光分子,将另一种样品如肿瘤组织或发病组织标记上另一种发红光的荧光分子,用两种波长的激光激发微阵列上的样品,通过比较两种荧光在微阵列上某点的比例得知某类基因在两种组织中的差异。

微阵列上有样品组成的点阵,除了点之外,余下的是背景。如果玻璃片未经过表面化学处理,样品在玻片上结合不牢固,且容易扩散,造成背景高。若玻璃片经过表面化学处理后,点样的样品在微阵列上结合牢固,点的直径小,不扩散,从而点的密度增加,在进行荧光数据2018白菜网址大全时,仪器将点上的荧光强度与点周围的背景强度相比较,如果背景中含有与荧光波段相一致的物质,则背景强度增高,样品的荧光信号将减弱,干扰信号的读取。

参考资料:现代食品检测技术


【关键词】杂交信号,检测,结果运算,食品检测国家标准物质网 

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