点击接通在线客服
生物样品处理与芯片杂交(四)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-03

玻片:用于制作芯片的玻片必须特别清洁和平滑。玻片表面必须包被合适的功能基团,能将靶DNA片段固定住并防止其在杂交洗涤过程中被冲洗掉。经表面化学处理的玻片是一种持久的载体,它也有其特长。首先,DNA样品以共价键的形式结合在处理过的玻片上。第二,玻璃是一种耐用的材料,能够耐高温和高离子强度溶液的洗涤。第三,玻璃不是多孔材料,使杂交的容量能保持在最小,因此能提高探针与目标分子的退火效率。第四,由于材料的低荧光性,不会有背景的影响。最后,两种不同的探针能够标上两种不同的荧光标记,在一片芯片上同一个反应中同时孵育;尼龙就受到连续或平行杂交的限制。由上可知,以玻璃为载体的芯片更具有发展和应用的前景。

(三)点样样品

点样样品的制备是非常关键的一步。样品的纯度、杂交特异性直接决定自制芯片的质量和可信度。

Clontech公司的Arias中,Glass Array和Plastic Array上那8300个基因对应的80碱基长寡核苷酸序列是经过Clontech公司专利软件在GenBank中筛选出的同源性最低,又经Clontech实验确保能给出很强杂交信号的片段。这种精巧的设计保证很高的分辨率、灵敏度。可以通过基因公司订购这些寡核苷酸来制作自己的芯片。足够点l000次芯片的8.327个人类基因、5002个小鼠基因或者将近4000个大鼠基因的寡核苷酸片段(冻干)放在96孔板中,连同100个TypeⅡ玻片和杂交盒,200mL杂交液,全面满足中小型实验项目的需求。这些寡核苷酸序列数目齐全,质量可靠,能为自制芯片的灵敏度和分辨率提供可靠的保证,也避免了合成8000多基因的麻烦。

在Yeast Genome Oligo Set提供斯坦福大学酵母基因组数据库(SGD)里,从6307个酿酒酵母的开放阅读框中,挑选长度为70-mer。单链寡核苷酸和lO个对照,所有的序列经过BLAST保证同源性最低,避免非特异杂交。每种Oligo有2000pmol,足够点2000~6000张片。

对于较大规模制作芯片的用户,由于点样样品数目太多,即使采用高通量试剂盒还是不够方便。这时不妨考虑分子生物学的标准工作站——全自动核酸和蛋白纯化工作站。这可不同于那种单一样品大量纯化的系统,而是特别适合芯片制作的很多个样品小量纯化系统。

(四)芯片杂交

当两个不同来源的单链DNA分子(DNA片段)核苷酸序列互补时,在复性条件下,可以通过碱基互补配对成为双链“杂种”DNA分子(DNA片段),此过程称为DNA杂交。如果其中一个单链DNA分子(DNA片段)带有容易检测的标记物(DNAI探针),经杂交后就可以检测到另一个单链DNA分子(DNA片段)。转化子的总DNA,DNA探针与其杂交。菌落(或噬菌斑)原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到用于杂交的膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再用DNA探针与其杂交。用Southern印迹杂交法不仅可以鉴定重组子中含有重组DNA分子,而且还可以知道待检测的DNA分子(DNA片段)大小以及待检测的DNA片段在重组DNA分子中的位置,但是此方法操作比较麻烦。后两种方法操作比较简单,但是只能区别是否含有待检测重组DNA分子的重组子。菌落(或噬菌斑)原位杂交已广泛地用于从基因组DNA文库和cDNA文库中筛选含目的基因的重组子。

DNA杂交探针是指带有某种标记物的特异性核苷酸序列,能与该核苷酸序列互补的DNA进行退火杂交,并且可以根据标记物的性质进行有效的检测。早期用得较多的是弛P等放射性物标记的:DNA杂交探针,其具有高放射性,可用放射自显影检测,灵敏度高,但安全性低,弛P标记的核苷酸半衰期短(14.3d),探针不能长期保存。目前已广泛使用生物素、地高辛或荧光素等非放射性物标记的DNA杂交探针,它们可以根据各自的生物化学性质或光学特性进行检测。虽然灵敏度略低于放射性标记,但是安全、保存期长。

不论对ONA(片上就位合成寡核苷酸点阵芯片)或CDA(用微量点样技术制作cDNA点阵芯片)来说都是芯片检测的关键一步,在此步中发生靶标样品核酸与探针之间的选择性反应。反应双方中总有一方固定在芯片上,而另一方则在标记后通过流路或加样至芯片上,芯片杂交中固定在芯片上的,往往是成千上万的探针,而与之杂交的是经过标记(同位素或荧光)的样品核酸,此靶标样品核酸往往需先经过PCR扩增或克隆或逆转录(mRNA),然后打碎成文库。同位素或荧光标记则在扩增或逆转录过程中进行。标记的靶标与固定探针在经过试验确定的严谨条件下进行分子杂交。芯片杂交属于固一液相杂交,与膜上杂交相似。互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测,杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜),但严谨性要求则比较低,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度;若用于突变检测,要鉴别出单碱基错配,需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性2018白菜网址大全或者基因测序时,每个核苷酸或突变位都必须检测出来,通常设计出一套四种寡聚核酸,在靶序列上跨越每个位点,只在中央位点碱基有所不同,根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度,即可测定出该碱基的种类。

当杂交混合物中靶标浓度约10倍于互补分子时,出现假一级反应动力学。此时,杂交速率主要决定于探针浓度,探针浓度提高l倍,信号也增强1倍。假一级反应在结果定量中,大大有利于减轻制作点阵芯片中各单元点因靶标浓度不准确所导致的微小差异。这一点对于平行2018白菜网址大全尤其重要。

当靶标浓度等于或低于探针浓度时则出现二级反应动力学。此时固定。DNA(靶标)浓度的微小差异,将对杂交速率和信号绝对值产生较大的影响。目前合成经过变性处理成为单链DNA分子(DNA片段),用预先根据待检测的重组DNA分子制备的DNA探针与其杂交,进一步根据标记物检测杂交的DNA片段,出现阳性杂交的转化子就是预期的重组子。杂交的方法有Southern印迹杂交、斑点印迹杂交和菌落(或噬菌斑)原位杂交等。

Southern印迹杂交是先从转化子中提取总DNA,经限制性内切核酸酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分带,转移到用于杂交的膜上,变性处理后再用DNA探针与其杂交。斑点印迹杂交是把提取的转化子总DNA直接点样到用于杂交的膜上,变性处理后再用DNA探针与其杂交。菌落(或噬菌斑)原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到用于杂交的膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再用DNA探针与其杂交。用Southern印迹杂交法不仅可以鉴定重组子中含有重组DNA分子,而且还可以知道待检测的:DNA分子(DNA片段)大小以及待检测的:DNA片段在重组DNA分子中的位置,但是此方法操作比较麻烦。后两种方法操作比较简单,但是只能区别是否含有待检测重组DNA分子的重组子。菌落(或噬菌斑)原位杂交已广泛地用于从基因组DNA文库和cDNA文库中筛选含目的基因的重组子。

DNA杂交探针是指带有某种标记物的特异性核苷酸序列,能与该核苷酸序列互补的DNA进行退火杂交,并且可以根据标记物的性质进行有效的检测。早期用得较多的是32P等放射性物标记的DNA杂交探针,其具有高放射性,可用放射自显影检测,灵敏度高,但安全性低,32P标记的核苷酸半衰期短(14.3d),探针不能长期保存。目前已广泛使用生物素、地高辛或荧光素等非放射性物标记的DNA杂交探针,它们可以根据各自的生物化学性质或光学特性进行检测。虽然灵敏度略低于放射性标记,但是安全、保存期长。

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

生物样品处理与芯片杂交(一)

生物样品处理与芯片杂交(二)

生物样品处理与芯片杂交(三)


【关键词】生物,样品处理,芯片杂交,食品检测国家标准物质网 

<< 上一篇:杂交信号检测和结果运算(一)

>> 下一篇:热2018白菜网址大全技术的原理及应用(三)