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杂交信号检测和结果运算(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-04

点阵上的点直径范围为25~500μm,通常目前能达到的直径为(100±50)μm,科学家正在努力减小直径。因为点直径的变化对扫描结果的读取产生影响,如果点的直径大,荧光分子扩散的范围也大,则观察到的荧光强度相对较弱。

若在玻片上有灰尘或其他杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等,扫描结果将受到影响。微阵列上的点干燥后形成很薄的层,使得激光共聚焦扫描成为可能,精心地调整扫描仪的焦距,可避免检测出不需要的背景杂质,包括微阵列上的灰尘、玻璃中自带的荧光杂质产生的干扰信号,均可通过激光共聚焦的方式将其减少到最低程度。由于杂交因素影响,在微阵列上点与点之间的荧光强度差别很大。对微阵列扫描仪的要求要能够有较宽范围的灵敏度,通常来说,灵敏度调整范围为10000:l。

当荧光化合物或染料受到激光激发后将释放出荧光,在某一波长下有一最高释放强度。各种荧光化合物有各自特定的激发吸收值。如图13—13是FITC的波长对荧光激发强度曲线。从曲线图可见,在494nm波长下,有一激发高峰,在518nm下有一释放高峰,释放与激发高峰波长相差24nm,这一现象在微阵列使用的染料中较普遍。两高峰波长的差值在专业上称为Strokes shift。激发曲线的绘制过程如下:在单一波长下,变换激发波长在不同波长下测定荧光释放强度,释放荧光曲线的绘制过程则是在最长激发波长下开始增加波长,测定在不同波长下的荧光释放强度。微阵列扫描仪设计者通过阅读和2018白菜网址大全某中荧光染料的激发曲线和释放曲线,来确定适合某种染料的复合扫描激发波长,该波长的激发效率至少要达到50%~70%的水平。激发波长要避免太接近释放高峰对应的波长,否则荧光信号受到干扰,所以应在峰值的左边选择一激发波长。如对FTTC来说,建议的激发波长在470~495nm。荧光释放强度在某一范围内,与激发光的强度成正比,当荧光释放达到最高峰后,增加激发光强度却不能提高释放强度,因为荧光释放已经达到饱和或光子将染料破坏淬灭。微阵列上各点的荧光分子受到激发后,从各个方向释放荧光光子,散射成球状,所以扫描仪须将这些

散射的光子采集到,由于扫描仪使用的是很低的释放光,几何球状是设计扫描设备的主要根据。

二、结果运算

一、运算结果

生物芯片的应用过程产生了大量的关系复杂的数据,处理和2018白菜网址大全这些数据并从中挖掘出有意义的生物信息,已成为限制该技术进一步发展的主要“瓶颈”,寻求有效的数据处理方法成为一重点研究对象。

(一)原始数据的获取及处理

1、原始数据的获取

用图像扫描仪捕获芯片上的荧光或同位素信号,由此获得的图像就是基因芯片的原始数据。此后还需用图像2018白菜网址大全软件从中提取各点的吸光度值、面积和吸光度比等数据并转化成基因表达矩阵(Gene expressionmatrix),才能进行进一步的统计学和生物学2018白菜网址大全。

2、原始数据的处理

当前已开发出许多相关图像处理2018白菜网址大全软件。它们能自动定位并识别芯片上每个杂交点,通过背景调整或分割技术除去图像上各种形式的噪声,再定量各点的信号强度比率,最后决定相应基因的表达变化情况。

(1)背景处理:图像上各点的吸光度值包含了样品和背景信号,在提取数据前必须将背景扣除,一般解决办法是以芯片图像中每个方格(Grid)内除杂交点以外各像素的吸光度平均值作为背景,将各点的强度减去这个背景值即可。然而这种方法并不准确而且会使l%~5%的点产生无意义的负值。Brown等提出,利用整个芯片杂交点外的平均吸光度值作为背景的Best-fit方法,使该问题得到较好的解决,并有效地提高了处理数据的质量。

(2)杂交点质量:由于点样或膜变形等原因目前较多的软件对杂交点的识别定位仍需要人为的干预和调整。以玻璃等硬质材料为片基的芯片,其杂交点边缘一般比较清晰易于界定,但对于膜阵列芯片,通常杂交点边缘比较模糊不易识别,且背景难以确定易造成误差。为此,Jain等开发出一个完全自动化的图像处理软件,从斑点的划格、定位到计算吸光度比值等,都不需人工参与,并且获得的数据较可靠。

(3)数据的标准化:其目的是避免基因芯片实验中因系统差异(Systematicvaria-tion)造成芯片问数据比较的困难。大部分标准化的方法采用调整标准化系数,使平均比值(Ratio)为1或平均Ratio对数值为O。最常用的是“看家基因(House-keepinggene)”法,它预先选择一组表达水平不变的看家基因,计算出这组基因平均Ratio值为l时的标准化系数,然后将其应用于全部的数据以达到标准化的目的。此外,整体平均值法(Global mean normalization)和密度依赖(Intensity—dependent)标准化法也很常用。

(二)标准化数据的统计学2018白菜网址大全

原始数据标准化并转化成基因表达矩阵后,通过统计学2018白菜网址大全,可从中揭示出一些重要的生物学信息。目前大致有两类2018白菜网址大全方法即差异2018白菜网址大全和聚类2018白菜网址大全。

1、差异2018白菜网址大全

主要目的在于筛选出不同条件下表达明显差异的基因。当比较两个不同生物样本时,可根据Ratio值来筛选。然而由于不同实验数据变化差别很大,因此根据实验条件不同来调整域值更为合理。在2018白菜网址大全两种生物条件下多个重复样本的数据时,可通过t检验来筛选差异基因。最近Jin等用无参数的Mann—Whitney方法鉴别差异表达的基因,观察了卡托普利(Captopril)对心肌梗死大鼠心肌组织基因表达水平的影响,结果用定量PER验证,发现基本没有假阳性,在比较多种生物条件下的芯片数据时,可用F检验筛选特异表达的基因。有时需要鉴别基因的某一特定行为,则可采用假表达谱(Pseudo profile)的方法。此外,聚类中的监督2018白菜网址大全方法同样也适于这种情况下的候选基因的鉴别。

2、聚类(Clusting)2018白菜网址大全

根据统计2018白菜网址大全原理,将具有相同统计行为的基因进行归类,从而发现生物学行为相似或相关的一组基因,常采用监督(Supervised)2018白菜网址大全和非监督(Unsupervised)2018白菜网址大全的策略。监督2018白菜网址大全是根据已知的参考向量(Vector)对基因进行分类,通过建立分类标准,将未知基因“安排”进已知基因的分类中,以此来预测新基因的功能。非监督2018白菜网址大全没有已知参考向量,只是将相同表达行为的基因或样品归为一类,在此基础上寻找相关基因,2018白菜网址大全基因的功能。它们均可实现大量表达数据的简化。

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

杂交信号检测和结果运算(一)


【关键词】杂交信号,检测,结果运算,食品检测国家标准物质网 

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