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生物样品处理与芯片杂交(五)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-08-04

不论对ONA(片上就位合成寡核苷酸点阵芯片)或CDA(用微量点样技术制作cDNA点阵芯片)来说都是芯片检测的关键一步,在此步中发生靶标样品核酸与探针之间的选择性反应。反应双方中总有一方固定在芯片上,而另一方则在标记后通过流路或加样至芯片上,芯片杂交中固定在芯片上的,往往是成千上万的探针,而与之杂交的是经过标记(同位素或荧光)的样品核酸,此靶标样品核酸往往需先经过PCR扩增或克隆或逆转录(mRNA),然后打碎成文库。同位素或荧光标记则在扩增或逆转录过程中进行。标记的靶标与固定探针在经过试验确定的严谨条件下进行分子杂交。芯片杂交属于固一液相杂交,与膜上杂交相似。互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测,杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜),但严谨性要求则比较低,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度;若用于突变检测,要鉴别出单碱基错配,需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性2018白菜网址大全或者基因测序时,每个核苷酸或突变位都必须检测出来,通常设计出一套四种寡聚核酸,在靶序列上跨越每个位点,只在中央位点碱基有所不同,根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度,即可测定出该碱基的种类。

当杂交混合物中靶标浓度约10倍于互补分子时,出现假一级反应动力学。此时,杂交速率主要决定于探针浓度,探针浓度提高1倍,信号也增强1倍。假一级反应在结果定量中,大大有利于减轻制作点阵芯片中各单元点因靶标浓度不准确所导致的微小差异。这一点对于平行2018白菜网址大全尤其重要。

当靶标浓度等于或低于探针浓度时则出现二级反应动力学。此时固定。DNA(靶标)浓度的微小差异,将对杂交速率和信号绝对值产生较大的影响。目前合成技术能制造出高浓度的靶标芯片,所以可以在较宽的样品浓度中呈现出假一级动力学。大部分已发表的ONA和CDA2018白菜网址大全的论文中应用的芯片都含有过剩的固定化靶标DNA。

一价阳离子如Na+的存在可以提高异源杂交双链生成的速度。其原理是Na+可掩蔽带负电磷酸根骨架,后者可影响靶标与探针分子间碱基配对的互相作用。通常在ONA和CDA芯片杂交时应用的Na+浓度为1mol/L。肽核酸探针的杂交几乎不受盐浓度的影响。倘若杂交温度显著地低于异源杂交物的熔点时,温度对杂交速率有正效应。一般,ONA和CDA试验中杂交温度分别为25~420C及55~70℃。最佳的盐浓度和杂交温度需通过试验来判定。

序列组成是最不能控制的参数,而对ONA的影响要大于CDA。G:c间形成三个氢键,而A:T间形成二个氢键,所以富GC区杂交双链的稳定性较好。当这些稳定区长度达到约50个碱基时,可以产生“成核”区,异源双链由此延伸。考虑到在1次芯片杂交中将会形成成千上万个异源杂交物,所以有必要选择出一个最协调的杂交条件,使信噪比对尽可能多的异源双链为最佳。这一条件可引入适当的阳性和阴性对照序列加至芯片,也可以在一些阳性对照中用添加法试验出来。

ONA的杂交物理化学显然与CDA不同,ONA杂交受CC含量影响明显大于较长的DNA序列。为了减少这一影响,可以在杂交混合液中加入一些能平衡AT及GC杂交结合能的试剂,如四甲基氯化铵(TMAC)。而在0.5~2.0kb的CDA序列中,碱基比例的影响要小得多,所以不必用TMAC。这一因素在用ONA芯片的再测序和诊断中需要研究。

杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤,洗涤除去未杂交的一切残留物。这一步骤也需要包括在杂交流路中。已经商品化的杂交室有Mfymetrix的Genechip Fluidi—tics,Telchem公司的ArraylTl'M,Hybn—dizationCassette,Nanogen公司的芯片卡套。

总的来说,杂交特异性和交叉杂交是重要而复杂的,不论在ONA或CDA芯片的应用中都要认真考虑。

ONA及cDA两种类型的DNA芯片的典型制作方法及操作流程见图13一11及图13—12。

CDA操作程序:取得目的基因模板,用PCR扩增。经纯化和质控后取5rtl,用微机控制的高速机械手将其印点于涂层载玻片上。测试和参比样品所得的总RNA分别用Cy-3及Cy-5-duTP于反转录时引入标记,荧光标记靶标混合后在严谨条件下与芯片上克隆阵列杂交。芯片上杂交固定的荧光靶标用激光光源激发,发射出特定波长的荧光用激光共聚焦显微镜扫描,所得单色图像输入软件。测得各点上靶标的信息包括:基因名称、克隆鉴定、强度和比例、归一化参数和可信限。一次杂交试验的数据用归一化(Cy3:Cy5)表示:比例为1表示测试与参比样品基因表达水平无变化,比例>1表示增高,比例<l表示降低。用数据储存方法可以比较多次观察结果。

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

生物样品处理与芯片杂交(一)

生物样品处理与芯片杂交(二)

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生物样品处理与芯片杂交(四)


【关键词】生物,样品处理,芯片杂交,食品检测国家标准物质网 

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