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放射免疫技术在食品检测中的应用(二)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-06

(三)单层非竞争法

先将待测物与固相载体结合,然后加入过量相对应的标记物,经反应后,洗去游离标记物测放射量。即可算出待测物浓度。本法可用于抗原、抗体,方法简单,但干扰因素较多。

(四)双层非竞争法

预先制备固相抗体,加入待测抗原使成固相抗体一抗原复合物,然后加入过量的标记抗体,与上述复合物形成抗体-抗原-标记抗体复合物,洗去游离抗体,测放射性,便可测算出待测物的浓度。与ELISA的双抗体夹心法相似。见图14—8。

三、抗体的同位素标记

(一)标记物

标记用的核素有放射γ射线和卢射线两大类。前者主要为131I、125I、57Cr和60Co;后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。例如125I比活性的理论值是64.38×104GBq/g(1.74×104Ci/g),有较长半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g(4.5Ci/g)。两者相比,1mol125I或14C结合到抗原上,125I的敏感度约比14C大3900倍。又因为125I有合适的半衰期,低能量的γ射线易于标记,因而125I是目前常用的RIA标记物。

《二)标记方法

标记125I的方法可分两大类,即直接标记法和间接标记法。

直接标记法是将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上。此法优点是操作简便,为125I和蛋白质的单一步骤的结合反应,它能使较多的125I结合在蛋白质上,故标记物具有高度比放射性。但此法只能用于标记含酪氨酸的化合物。此外,含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性,则该活性易因标记而受损伤。

间接标记法(又称连接法)是以125I标记在载体上,纯化后再与蛋白质结合。由于操作较复杂,标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。但此法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质。如直接法标记弓I起蛋白质酪氨酸结构改变而损伤其免疫及生物活性时,也可采用间接法。它的标记反应较为温和,可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失。下面介绍最常用的氯胺T直接标记法。

氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐,在水溶液中逐渐分解形成次氯酸,是一种氧化剂。在偏碱溶液中(pH 7.5),氯胺T将125I的I-氧化为I+,I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢,形成二碘酪氨酸。反应式如下:

放射性碘标记率的高低与抗原(蛋白质或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有关,当分子中含有较多的酪氨酸,又暴露在外时,则标记率就高。

标记方法:将纯化抗原和125I加入小试管底部,然后将新鲜配制的氯胺T快速冲入,混匀振荡数十秒~2min后,加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加入Ⅺ溶液稀释。然后在葡聚糖G柱上分离,逐管收集。分别用井型闪烁计数器测定放射性强度(脉冲数/min,cpm),前部为标记抗原峰,后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管内加等量l%白蛋白作稳定剂,此即为标记抗原液。

(三)标记物的鉴定

(1)放射性游离碘的含量用三氯醋酸(预先在受鉴定样品中加入牛血清白蛋白)将所有蛋白质沉淀,分别测定沉淀物和上清液的计数率(cpm)。一般要求游离碘在总放射性碘的5%以下。标记抗原在储存过久后,会出现标记物的脱碘,如游离碘超过5%则应重新纯化去除这部分游离碘。

(2)免疫活性标记时总有部分抗原活性损失,但应尽量避免。检查方法是用小量的标记抗原加过量的抗体,反应后分离B和F,分别测定放射性,算出BT%。此值应在80%以上,该值越大,表示抗原损伤越少。

(3)放射性比度标记抗原必须有足够的放射性比度。比度或比放射性是指单位重量抗原的放射强度。标记抗原的比放射性用mCi/mg(或mCi/mm01)表示。比度越高,测定越敏感。标记抗原的比度计算是根据放射性碘的利用率(或标记率):

如:5μLhGH用2mCiNa125I进行标记,标记率为40%,则:

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

放射免疫技术在食品检测中的应用(一)


【关键词】放射免疫,放射性核素,食品检测国家标准物质网 

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