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放射免疫技术在食品检测中的应用(三)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-07

(四)抗血清的检定

含有特异性抗体的抗血清是放射免疫2018白菜网址大全的主要试剂,常以抗原免疫小动物诱发产生多克隆抗体而得。抗血清的质量直接影响2018白菜网址大全的灵敏度和特异性。抗血清质量的指标主要有亲和常数、交叉反应率和滴度。

(1)亲和常数(Affinityconstant):亲和常数常用K值表示,它反映抗体与相应抗原的结合能力。K值的单位为mol/L,即表示1mol抗体稀释至若干升溶液中时,与相应的抗原结合率达到50%。抗血清K值越大,放射免疫2018白菜网址大全的灵敏度、精密和准确度越佳。抗血清的K值达到lO9一1012mol/L才适合用于放射免疫2018白菜网址大全。

(2)交叉反应率:放射免疫2018白菜网址大全测定的物质有些具有极为类似的结构,例如甲状腺素的T3、T4,雌激素中的雌二醇、雌三醇等。针对一种抗原的抗血清往往对于其类似物会发生交叉反应。交叉反应率是使标记抗原与抗体反应最大结合率抑制下降50%时,特异性抗原与类似物的剂量(ED50)之比。如胰岛素标准品使瞄I胰岛素与抗血清的最大结合下降50%的用量为O.5ng,而类似物(前体)胰岛素原的用量为500ng,则相应的交叉反应率(%)为:0.5/500=0.1%。因此交叉反应率反映抗血清的特异性,交叉反应率过大将影响2018白菜网址大全方法的准确性。

(3)滴度滴度指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度,它反映抗血清中有效抗体的浓度。在放射免疫2018白菜网址大全中滴度为在无受检抗原存在时,结合50%标记抗原时抗血清的稀释度。

四、放射免疫测定方法

(一)液相放射免疫测定

1、抗原抗体反应

将抗原(标准品和受检标本)、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中,在一定的温度下反应一定时间,使竞争抑制反应达到平衡。不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。如受检标本抗原含量较高,抗血清的亲和常数较大,可选择较高的温度(15~370C)进行较短时间的温育,反之应在低温(4℃)做较长时间的温育,形成的抗原抗体复合物较为牢固。

2、B、F分离技术

在RIA反应中,标记抗原和特异性抗体的含量极微,形成的标记抗原抗体复合物(B)不能自行沉淀,因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀,以完成与游离标记抗原(F)的分离。另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。

(1)第二抗体沉淀法:这是RIA中最常用的一种沉淀方法。将产生特异性抗体(第一抗体)的动物(例如兔)的IgG免疫另一种动物(例如羊),制得羊抗兔IgG血清(第二抗体)。由于在本反应系统中采用第一、第二两种抗体,故称为双抗体法。在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体,形成由抗原一第一抗体一第二抗体组成的双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低,其复合物也极少,无法进行离心分离,为此在分离时加入一定量的与第一抗体同种动物的血清或:lgG,使之与第二抗体形成可见的沉淀物,与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原(B)的沉淀物沉淀,与上清液中的游离标记抗原(F)分离。

(2)聚乙二醇(I)EG)沉淀法:最近各种RLA反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。PEG沉淀剂的主要优点是制备方便,沉淀完全。缺点是非特异性结合率比用第二抗体为高,且温度高于30%时沉淀物容易复溶。

(3)PR试剂法:PR试剂法是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法。此法保持了两者的优点,节省了两者的用量,而且分离快速、简便。

(4)活性炭吸附法:小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附,大分子复合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖,使它表面具有一定孔径的网眼,效果更好。在抗原与特异性抗体反应后,加入葡聚糖一活性炭。放置5~10min,使游离抗原吸附在活性炭颗粒上,离心使颗粒沉淀,上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素,强心糖苷和各种药物,因为它们是相对非极性的,又比抗原抗体复合物小,易被活性炭吸附。

3、放射性强度的测定

B、F分离后,即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类,液体闪烁计数仪(届射线,如3H、32P、14C等)和晶体闪烁计数仪(β射线,如125I、131I、57Cr等)。

计数单位是探测器输出的电脉冲数,单位为cpm(计数/min),也可用cps(计数/s)表示。如果知道这个测量系统的效率,还可算出放射源的强度,即dpm(衰变/min)或dps(衰变/s)。

每次测定均需作标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图(图14—9)。放射性强度可任选B或F,也可用计算值B,(B+F)、B/F和B/B0。标本应作双份测定,取其平均值,在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。

(二)固相放射免疫测定方法(以双层非竞争法为例)

1、抗体的包被

先将抗体吸附于固相载体表面,制成免疫吸附剂。常用的固相载体为聚苯乙烯,形状有管、微管、小圆片、扁圆片和微球等。还可根据自己的工作设计新的形状,以适应特殊的需要。

2、抗原抗体反应

免疫吸附剂与标本一起孵育时,标本中的抗原与固相载体上的抗体发生免疫反应。当加入125I标记的抗体后,由于抗原有多个结合点,又同标记抗体结合最终在固相载体表面形成抗体一抗原一标记抗体免疫复合物。

3、B、F分离

用缓冲液洗涤除去游离的标记抗体,使B、F分离。

4、放射性强度的测定

测定固相所带的放射性计数率(cpm),设样品cpm值为P,阴性对照标本cpm值为N,则P/N≥12.1为阳性反应。标本中的抗原越多,最终结合到固相载体上的标记抗体越多,其cpm值也就越大;反之则小。当标本中不存在抗原时,其cpm值应接近于仪器的本底计数。

五、放射免疫在食品检测中的应用

放射免疫2018白菜网址大全由于敏感度高、特异性强、精密度高,不仅可以检测经食品传播的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫,还可测定小分子质量和大分子质量物质,在食品检验中应用极为广泛,如南京农业大学等单位用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。从20世纪80年代开始,农药的免疫检测技术作为快速筛选检测得到许多发达国家的高度重视,成为食品生物技术的一个重要分支,得到了快速发展。放射免疫等技术由于可以避免假阴性,适宜于阳性率较低的大量样品检测,在食品农药残留检测中应用。

放射免疫检测技术对所测样品的前处理要求简单,多数样品可直接用于测试。目前,研制成功了许多检测试剂,运用这一技术开展了对食品农药残留的生物技术检测研究,对水产品,肉类产品、果蔬产品中的农药残留量进行监测。

参考资料:现代食品检测技术

相关链接:

放射免疫技术在食品检测中的应用(一)

放射免疫技术在食品检测中的应用(二)


【关键词】放射免疫,放射性核素,食品检测国家标准物质网 

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