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紫外-可见分光光度法之定性与定量2018白菜网址大全(五)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-07

(一)计算分光光度法测定多组分的原理

某一样本有n个组分,在ι(ι>n)个波长点上测得其吸光度值,根据比尔定律及吸光度的加和性,在线性范围内有:

写成矩阵形式:

                      (8-8)

式中A、εc——分别为对应的吸光度、摩尔吸收系数和组分的浓度值

如果ε矩阵已知并且是非退化矩阵,只要测量出待测样本的吸光度值,理论上便可从式(8—8)解出待测样本的各组分浓度。

(二)计算分光光度法测定多组分的实验方法

1摩尔吸收系数矩阵ε的求解

ε矩阵通常用单一组分标准溶液法及混合组分准样溶液法。

(1)单一组分标准溶液法即配制混合物的各组分的单一纯品溶液(组分浓度与待测样品该组分浓度相近),在ι个波长点上测纯组分的吸光度,由比尔定律A=εc便能换算出对应波长的摩尔吸收系数ε,再由各组分各波长的ε值,便可组成摩尔吸收系数ε矩阵。这种方法虽然简单,但实验的偶然误差会导致测量结果的精度不高,因此不是理想的方法。

(2)混合组分标准样溶液法配制m(mn)个各组分浓度组合不同的混合标准溶液,得到浓度矩阵cn×m,在ι个波长点上分别测量它们的吸光度,得到吸光度矩阵Aι×m,便可用根据比尔定律及矩阵算法可推出求解ε的公式:

                     (8-9)

通过式(8—9)已知的浓度矩阵cn×m和吸光度矩阵Aι×m,可求出摩尔吸收系数矩阵ει×m

2混合标准溶液的配制

在计算分光光度法的诸方法中均要用到混合标准溶液,应使m个混合标准溶液具有代表性和覆盖性,因而在具体配制安排中应注意如下几点。

(1)混合标准溶液的个数m≥(2~3)n(n为组分数),若能保证精度,m可选择小些以减少工作量。为使各组分浓度配制得均匀、分散、整齐、可比,可用正交试验设计法安排。如三组分可选用L9(34)、U7(76)、U998),四组分可选用L16(45)、U11(1l10)、U13(1312)。    

(2)混合标准溶液各组分的浓度水平的上下限,应比实际样品浓度变化范围宽。如样品浓度允许的变化范围为其平均值的80%~120%,则浓度水平的上下限可定为平均值的130%和70%;组分浓度的间隔小一些会提高均匀性。但如果间隔过小(如浓度间隔在0.01mg/L以下),水平数过多,实际操作难以控制,试验结果反而不好,这时可以不减少试验次数(即混合标准个数),采用拟水平办法缩小水平数。

(3)混合标准溶液组分的平均浓度应靠近待测样品组分的浓度,含量最高的混合标准溶液吸光度值应落在吸光度的线性范围,一般其吸光度值A≤1.0较好。

3检测波长位置的选择

在同时测定多组分的计算分光光度法的应用中,选择恰当的测定波长的位置,对改善检测结果也很重要,一般应遵从如下原则。

(1)各组分吸光度在该波长处加和性良好。

(2)波长点尽可能包含各组分的特征峰。

(3)波长点应选在组分吸收曲线的峰顶处,或混合物吸收曲线的顶部较为平坦处,不应选在曲线上升(或下降)的陡部。

(4)不同的波长点应突出某个组分的较大的吸收系数,而不应同时突出两个组分的较大的吸收系数,以保证求逆矩阵时计算误差较小。

不同的计算分光光度2018白菜网址大全方法对上述诸点的苛求程度不同,但对于测定波长点数较少时应注意尽量满足,以提高测量的准确度。

(三)几种计算分光光度2018白菜网址大全法简介

现将文献中报道的七种多组分同时测定方法的原理、特点和适应范围做一简介。

1、AKC矩阵法

当式(8—13)中测定波ι个数z等于组分数n时,求解各组分浓度的方法,称为AKC矩阵法。该法就是经典的线性方程组法。只要知道ε矩阵,测定待测样本几个波长上的吸光度值便能通过一次求逆求出n个组分的浓度,此法比较简单,理论上适用于任意多组分体系的测定。但由于选择波长点数少,而测量操作也必然存在误差,所以如果某一波长位置选择不当,方程为病态方程组时,测定误差较大。AKC矩阵法只适用于组分数较少的简单体系的测量。

2、最小二乘法

当式(8—13)中测量的波长个数ι大于组分数n时,方程个数多于待求未知组分数,便组成矛盾方程组。根据残差平方和最小原理而建立的多元线性拟合法求解多组分浓度的方法,称为最小二乘法。此法可选波长个数ι=(n+4)一(n+6)。ι过小,提供信息量不足,ι过大,对结果改进作用不大。本法对波长位置的选择无需像AKC法那样严格,结果精度也较AKC法高。本法的不足之处是有时个别组分的计算结果误差稍大。

3、CPA矩阵法

最小二乘法要求进行二次求逆才能求解组分的未知浓度,故计算时的舍人误差有时较大。(]PA矩阵法是将吸收定律的数学表达式变形,用浓度作为吸光度函数的CPA矩阵(简称P矩阵)法,求解多组分浓度的方法。该法只需一次求逆,波长个数ι一般也小于最小二乘法,而测定结果多数情况会比最小二乘法好。

4、岭回归法

以上三种方法都采用了求逆计算,但当求逆时的系数矩阵接近退化时,其最小特征根(Ymin)接近零,会令用回归法求得的组分浓度严重失真,因此均要求仔细选择测定波长位置。岭回归法人为地引进了一个经计算求得的岭参数K(KO),使最小特征根变为Ymin+K,从而使岭回归估计值优于一般的回归估计值。

岭回归法虽然也采用了求逆计算,但同上述三种方法相比,可以使用较多的波长个数,且对波长位置的选择不太苛求,是对多元线性回归法的改进。岭回归法是解决系数矩阵接近退化时的病态方程组问题极有效的方法之一。

5偏最小二乘法(PLS)

PLS法利用m个混合标准的浓度矩阵cm×nι个波长点上的吸光度矩阵Am×1按照一定的数学算法进行迭代计算,而求解组分浓度的多元统计2018白菜网址大全法。

PLS法是一种能充分利用混合标准中的浓度和吸光度信息,不用求逆的数据处理方法。它有较强的抗随机干扰能力,对波长点位置的选择不太苛求,是多组分同时测定的有效方法之一,也是解决系数矩阵接近退化时的病态方程组问题极有效的方法之一。

6、卡尔曼(Kalman)滤波法

Kalman滤波法是另一种不用求逆的求解多组分浓度的方法。滤波法就是从一系列含有干扰的吸光度信号中,尽可能滤除干扰,分离出所需的较为准确的浓度值递推滤波的方法。因Kalman法是利用递推计算,故方便与仪器联机使用,但不足之处是抗随机误差能力不理想。

以上各种方法是以线性关系为基础,而20世纪90年代被广泛应用、能解决非线性拟合的人工神经网络技术,同样能有效求解多组分浓度。

计算分光光度法的应用将大大减少乃至无需进行物理的或化学的分离过程,通过所谓“数学分离”方法直接对各组分进行测定。计算分光光度法借助于计算机的帮助,使2018白菜网址大全测定条件变得优化,操作变得简单,提高了功效。但是,计算分光光度法并非很完善,方法本身还需提高,内容尚待进一步提炼和充实,当前,更重要的是如何开发出具有实用价值的“计算分光光度法多组分测量系统”仪器或软件。

六、紫外-可见分光光度法的特点

(一)入射光接近于单色光

与比色法相比,比色法的入射光是一段谱带较宽(比如50nm)的光谱带,而分光光度法则不同,其入射光必须接近于单色光,光谱带宽度最多不超过3~5nm,最窄的在lnm以下。所以,分光光度法所需的入射光不是用滤色片(光电比色法采用滤色片分单色光)分离出来的,而是用棱镜或光栅分出不同波长的光。采用分光光度法的仪器称为分光光度计,其结构较光电比色计复杂、精密。

(二)2018白菜网址大全对象广

紫外-可见分光光度法应用很广泛,对于有色化合物(或与某种物质反应后能产生有色物质的化合物)和分子含有不饱和键的无色化合物均可进行有效2018白菜网址大全。

例如食品中维生素A、维生素D可在328nm、265nm波长下分别测定,食品中的添加剂苯甲酸可在225nm波长下测定,啤酒中的苦味成分异α-酸可在275nm波长下测定。

(三)灵敏度及准确度高

由于分光光度法的入射光是以棱镜或光栅为分色器,同时又用窄缝分出的谱带很窄的一束单色光,因此其测定的灵敏度、选择性和准确度很高。紫外一可见分光光度法可测定微量物质,测定灵敏度可达10-710-4g/mL,定量测定的精密度一般为0.5%,而在校正过的仪器上测定精密度为0.2%。

(四)选择性好,操作简便

由于分光光度法使用的是单色光,而且随着计算分光光度法的推广,用它来测定含有两种或两种以上组分的试样时,不必事先进行分离,而只要选用不同种特定波长的单色光即可,2018白菜网址大全操作容易掌握。此外,紫外-可见分光光度法还具有仪器设备简单价廉的特点。

尽管紫外-可见分光光度法在定性方面赶不上红外光谱,在定量的准确度、精度及灵敏度等方面赶不上液相、气相、质谱、电子鼻或电子舌等高精度的仪器,但由于该法具有上述优点,考虑到仪器的性价比良好,因此在食品2018白菜网址大全中,特别是定量2018白菜网址大全中,紫外-可见分光光度法的应用还是相当广泛的。

参考资料:现代食品检测技术

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【关键词】紫外-可见分光光度法,食品检测,定性,定量,国家标准物质网 

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