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PCR扩增产物的检测2018白菜网址大全
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-08

目前检测PCR扩增产物的方法包括凝胶电泳、层析技术、核酸探针杂交、酶切图谱2018白菜网址大全、单链构型多态性2018白菜网址大全、核酸序列2018白菜网址大全等。

一、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是检测PCR扩增产物最常用的方法之一。不同目的的电泳可使用各种浓度的凝胶;不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离DNA片段大小的范围参数列于表11—2。

核酸凝胶电泳结果的检测方法有溴化乙锭染色、银染色及同位素放射自显影等,其中溴化乙锭染色法较为普遍。溴化乙锭(Ethidium Bromide,简称EB)是一种荧光剂,由于溴化乙锭分子插人在DNA双螺旋结构的两个碱基之间后,能形成一种在紫外光激发下发出很强橙红色荧光的络合物,所以十分容易观察。检测的灵敏度非常高,1μg/mL的溴化乙锭溶液可检出10ng或更少的DNA样品。演化乙锭产生的荧光在紫外光源下放置时间过长能被淬灭,也容易受一些化学物质的污染而淬灭。溴化乙锭是一种DNA诱变剂,使用时应注意避免与皮肤接触。实验室中的EB污染物应妥善处理,:EB溶液的污染物不能直接倒入下水道及垃圾中,含有EB的凝胶应在干燥后烧毁。

用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA片段的分子质量,是在同一块凝胶板上样品槽中加待测样品,加一个标准分子量样品同时进行电泳,然后用溴化乙锭染色,通过生物凝胶成像2018白菜网址大全系统或紫外灯比较样品与标准品的位置,即可估计出待测样品的分子量大小范围。实验室常用的DNA分子量标准只有pBR322和ADNA的酶切片段。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胶凝胶电泳具有琼脂糖凝胶电泳所不具备的优点:①分辨率很强,长度仅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开;②能装载的DNA量远大于琼脂糖凝胶,一个加样槽(1cm×1cm)中加入lOμg DNA也不会明显影响分辨率;③从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。另外,可以采用银染色法染聚丙烯酰胺凝胶中的DNA和RNA,其灵敏度比溴化乙锭染色法高2~5倍,而且避免溴化乙锭迅速退色的弱点,银染的凝胶干燥后可长期保存。:PCR扩增指纹图,多重。PCR扩增,PCR产物的酶切2018白菜网址大全及利用产物的限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)进行基因分型时,聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种理想的手段。不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶,可以分离DNA片段大小的范围参数列于表11—3。

三、核酸探针杂交鉴定法

为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段,或产物是否有突变,都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。点杂交无需进行电泳,直接对产物进行2018白菜网址大全鉴定,还可将样品稀释成一系列不同浓度,对扩增产物进行定量2018白菜网址大全。该法灵敏度较高,特别适用于特异性不高的PCR扩增产物2018白菜网址大全。其基本过程是将扩增产物固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上,用放射性或非放射性标记的探针杂交,还可将不同的探针固定到膜上,用标记的扩增产物进行杂交,称为“反向点杂交法”,该法可同时检测多个突变位点或多种病原体。目前主要用寡核苷酸探针杂交(ASO)检测点突变。

采用常规的Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性,检测灵敏度可达10ng。基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳,然后印迹转移到尼龙膜上,再用标记的探针进行杂交检测。

四、限制性内切酶2018白菜网址大全

酶切2018白菜网址大全是鉴别PCR扩增产物特异性的一种简便方法。根据目标基因的已知序列资料可以查出包含的酶切位点,用某种限制性内切酶消化扩增产物后进行电泳,观察消化片段的数目及大小是否与序列资料相符,从而确定产物的特异性。酶切2018白菜网址大全的另一种用途是遗传病的诊断和传染病病原体的基因分型。酶切位点的改变是序列差异的遗传路标,因此可利用高频率切点的限制酶消化PCR扩增产物,根据限制性片段长度多态性(RFLP)进行目标基因2018白菜网址大全和分型。

特异性鉴别可选用识别6个碱基的限制性内切酶,从已知序列资料中查出。基因分型可用识别4个碱基的限制性内切酶,常用的有Alu I,Msp I,Taq I,Hinf I,Mbo I,Dde I,MseI.BbuI,MaeI,MaeⅢ,Fnu 4HI,HhaI,Rsa I等。

五、PCR扩增产物的直接测序

PCR技术在进行分子克隆和模板制备的大部分工作中显示了极大的优势,它不仅省略了通常制备DNA片段的繁琐步骤,也避免了使用亚克隆的经典程序。结合自动化测序技术,PCR将为了解核苷酸序列信息提供最快和最有效的手段。直接序列2018白菜网址大全是指在PCR扩增基因组DNA序列的基础上,直接进行基因核苷酸序列2018白菜网址大全的方法,是检测基因突变最有效、最直接的方法。用于直接序列2018白菜网址大全的方法主要有化学降解法Taq DNA聚合酶测序法、三引物法、不对称PCR法等。

参考资料:现代食品检测技术


【关键词】PCR基因,PCR扩增,食品检测国家标准物质网 

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