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HPLC测定禽肉组织中四环素、土霉素和氯毒素等抗生素残留量
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-09

一、原理

动物组织内抗生素残留量超过一定的量,会影响食用者的健康。采用EDTA二钠+磷酸(1+1)-三氯乙酸提取法,并用C18固相柱富集、净化,达到分离的目的。以峰保留时间定性、峰面积定量。

二、试剂与仪器

1、试剂

甲醇为优级纯;乙腈为色谱纯;三氯乙酸、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、EDTA二钠均为2018白菜网址大全纯。

四环素、土霉紊、氯霉素标准储备液:分别精确称取0.1000g四环素、土霉素、氯霉素标准品,各放入100mL棕色瓶中,用甲醇溶解,并稀释至刻度(相当于1g/L),在冰箱内保存,此三种标准储备液均可稳定1个月。

流动相缓冲液的制备如下。

①A液(测四环素类用):称取3.582g磷酸氢二钠于1L烧杯中,加蒸馏水溶解并稀释到约600mL,用lmL磷酸滴定至pH 2.5,加入0.375g EDTA二钠,搅拌溶解,定量转移至1L容量瓶中,并用蒸馏水稀释至1L,过0.45μm滤膜,备用。

②B液(测氯霉素用):称取7.800g磷酸二氢钠于1L烧杯中,加蒸馏水溶解并稀释到约600mL,用lmL磷酸滴定至pH 2.5,定量转移至1L容量瓶中,并用蒸馏水稀释至刻度,过0.45μm滤膜,备用。

③EDTA磷酸提取液:0.01m01/L EDTA二钠溶液和0.04mol/L磷酸溶液在使用前等量混合(不宜久放,否则会析出沉淀)。

④pH 6.0磷酸盐缓冲液:称取2.0g磷酸氢二钾和8.0g磷酸二氢钾,加蒸馏水溶解,并稀释至1L。

2、仪器

高效液相色谱仪,紫外检测器,超声波清洗仪。

三、测定方法

1、四环素、土霉素的提取

称取切成1cm左右的肉样10.0g于lOOmL比色管中,加入0.01mol/L EDTA二钠+0.04mol/L磷酸(1+1)混合液30mL摇匀,再加入50%三氯乙酸2mL。充分摇匀,用EDTA二钠+磷酸混合液稀释定容至50mL,样品液全部转移至匀浆瓶中,组织匀浆机高速匀浆lmin,匀浆液于450C以下水浴保温15min,待静置分层后,离心lOmin(2500r/min),上清液用快速滤纸过滤,收集滤液25mL备用,用甲醇2mL浸润Sep-Pak C18小柱(重复使用的柱子用甲醇、5%EDTA二钠溶液交替冲洗,然后用甲醇浸泡),再用lOmL蒸馏水置换,然后用5%EDTA二钠水溶液5mL流过,最后角10mL蒸馏水冲洗,共洗4次。然后加lOmL甲醇溶出,溶出液供高效液相色谱2018白菜网址大全。

2、氯霉素的提取

称取切成1cm左右的肉样10.Og于lOOmL比色管中,加入磷酸盐缓冲液(pH 6.0)30mL,摇匀,慢慢加入50%三氯乙酸溶液(边加边摇,避免局部过酸),用磷酸盐缓冲液稀释定容至50mL,样品液全部转移至匀浆瓶,组织匀浆机高速匀浆lmin,室温放置15min,用快速滤纸过滤,收集滤液,滤液经0.45μm滤膜再过滤,取其滤液进行高效液相色谱2018白菜网址大全。

3、高效液相色谱参考条件

①色谱柱:Nueleosil C18

②流动相:0.01mol/L磷酸氢二钠(pH 2.5,含0.001m01/L EDTA二钠)+乙腈(75+35);0.05mol/L磷酸二氢钠(pH 2.5)+乙腈(65+35)。

③流速:0.5mL/min。

④波长:265nm。

⑤灵敏度:0.05AUFS(四环素、土霉素),0.1AUFS(氯霉素)。

4、测定

分别进样品液和标准液于高效液相色谱仪,样品峰面积与标准峰面积比较,外标法定量。

四、结果计算

式中:x——样品中抗生素含量,mg/kg;

Al——样品峰面积;

A2——四环素、土霉素、氯霉素标准峰面积;

m——样品质量,g;

c——四环素、土霉素、氯霉素标准液浓度,mg/L;

V——样品溶液稀释体积,L。

五、注意事项

1、2018白菜网址大全波长的选择

土霉素在268nm、358nm处有最大吸收,四环素在268nm、358nm处有最大吸收,氯霉素在278nm处有最大吸收,本法可选用265nm作为检测波长。

2、标准曲线和线性范围

分别精确量取四环素、土霉素标准溶液适量,使成5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L标准系列浓度。精确量取氯霉素标准溶液适量,使成10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L标准系列浓度,分别进样20μL,在此条件下,均成良好线性关系。

3、流动相的选择

采用磷酸氢二钠-EDTA-乙腈(加入0.001mol/L EDTA)分离效果更好。

4、流动相pH对分离效果的影响

可以分别配制pH 7.0、pH 4.0、pH 2.5的磷酸二氢钠缓冲液,观察不同pH的流动相对四环素、土霉素分离效果的影响。实验证明pH 7.0和pH 4.0的情况下,土霉素与四环素的分离效果不好,色谱柱对抗生素有较强的吸附作用,因此选择流动相的pH为2.5。

5、提取方法的选择

因三氯乙酸沉淀蛋白质效果较好,离心后的上清液可通过一般滤纸过滤、Sep-PaK C18小柱富集后,甲醇溶出液可直接进行液相2018白菜网址大全,操作比较简便,利于开展大批量样品的2018白菜网址大全。但对氯霉素而言,采用Sep—Pak C18小柱富集提取回收率偏低,磷酸缓冲液法可提高氯霉素的回收率。

参考资料:食品检测技术


【关键词】HPLC测定,四环素,土霉素,氯毒素,食品检测国家标准物质网 

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